После смерти Лоренцо Великолепного в городе начался период перехода власти от одной семьи к другой и формирования нового образца правления. Постепенно Медичи стали правителями города. Возвышение к папскому престолу, сначала Джованни ди Медичи в 1512 году, и затем Джулио Медичи (Клемент VII), казалось, укрепило Медичи в роли правителей города еще больше. Но в 1527 году народ Флоренции восстал и еще раз выгнал Медичи, объявив себя свободным от какого-либо правления. Это было последней отчаянной попыткой восстановить республиканское правительство. 12 августа 1530 года, после одиннадцатимесячной осады, армии императора и папы римского вместе вошли во Флоренцию и в следующем году, с имперской концессией, Александр Медичи был объявлен «главой правительства и государства». Новый правитель приказал называть себя «Герцогом флорентийской республики», установил тиранию, подбирая под свой контроль все финансовые дела Флоренции и развивая внешнюю политику через брачные союзы с самыми важными правящими семьями в Европе, в частности, он женился на дочери Императора Карла V и отдал свою сводную сестру Катерину в жены второму сыну Франциска I (впоследствии она стала королевой Франции, известной, как Екатерина Медичи). Противники Медичи, возглавляемые Филиппо Строцци, напрасно пытались устранить Герцога Алессандро. Эти попытки были неудачны, но другой представитель семьи — Лоренцо ди Медичи, убил Алессандро в 1537 году. Единственным возможным преемником был Косимо иль Джаване (Cosimo il Giovane), сын Джованни делле Банде Нере (Giovanni delle Bande Nere), из младшей ветви семьи, начинающейся с линии Косимо Старшего. Хотя новому герцогу было всего семнадцать лет, он сумел внушить уважение к себе и постепенно установил деспотичный режим. За всю свою жизнь он преуспел в укреплении своего государства и в устранении неблагонадежных дворян, захватив Сиену, и закрепив над ней правление Флоренции в 1555 году. Он получил верховный титул от папы римского и 5-ого марта 1570 года был коронован, как Великий Герцог Тосканский Пием V. Когда он умер в 1574 году, он оставил правительство в руках своего сына Франческо, который правил до 1587 года, когда за ним следовал его брат Фердинандо I (1587-1609 гг.).